Modifikasi Germline Target Pada Spermatogonia Tikus Menggunakan CRISPR/CAS9

Spermatozoa merupakan hasil akhir dari proses spermatogenesis yang dihasilkan melalui fase mitosis, meiosis dan paska meiosis di dalam tubulus seminiferus testis.1 Gen-gen yang diekspresikan selama proses ini mengkode protein yang diperlukan untuk proses perkembangan sel germinal. Beberapa gen mengkode protein dengan peranesensial dalam struktur maupun fungsi spesifik untuk sel-sel spermatogenik dan ekspresi gen-gen ini dipengaruhi oleh isyarat ekstrinsik, tetapi ditentukan terutama oleh program genetik intrinsik sel-sel spermatogenik. Regulasi intrinsik ekspresi gen pada spermatogenesis terjadi dalam tiga tingkatan yaitu transkripsi, translasi dan paska translasi.2

Teknologi rekayasa gen telah lama bermanfaat untuk studi biologi reproduksi laki-laki. Namun, karena metode yang digunakan memakan waktu yang lama dan diperlukan biaya yang mahal menyebabkan teknologi ini jarang dilakukan. Dengan adanya sistem rekayasa gen CRISPR/Cas9 telah mengantar era baru penyelidikan genetik. Saat ini dimungkinkan menghasilkan rekayasa gen tikus percobaan dalam waktu yang sangat singkat dan dengan biaya yang sangat minimal.3

Sistem CRISPR/Cas9 menggantikan teknik editing genom sebelumnya seperti zinc finger nucleases (ZFNs) dan engineered transcription activator-like effector nucleases (TALENs), dimana keduanya bergantung pada domain nuklease dari endonuklease FOK I untuk memecah untai ganda DNA dan dibandingkan dengan ZFN dan TALENs, CRISPR/Cas9 jauh lebih mudah  memanipulasi dan karenanya memiliki aplikasi yang lebih luas. ZFN, misalnya, terdiri dari array domain ZF Cys2-His2, dengan masing-masing jari mengikat PAM tertentu, yang membuat sulit untuk memilih sekuens sasaran yang tepat. Dua ZFN membentuk dimer untuk mengetahui sekuens DNA 18-24 bp yang unik. Karena risiko target yang besar, kesulitan dalam rekayasa DNA-pengikat protein, dan persyaratan mengikat tergantung pada konteks, penerapan teknologi ZFN dan TALEN  masih sangat terbatas. Melalui makalah ini, penulis tertarik untuk meninjau literatur bagaimana CRISPR/Cas9 dapat berperan dalam modifikasi germline target pada spermatogonia tikus.4

CRISPR

Clustered regularly interspaced short palindromic repeats yang disingkat menjadi CRISPR adalah suatu segmen DNA tertentu pada prokariota (bakteri dan archaea) yang terdiri dari sekuens atau urutan nukleotida dengan repitisi pendek. Masing-masing repetisi tersebut diikuti dengan segmen pendek lainnya yakni DNA Spacer secara selang-seling (Gambar 5). Pada genom bakteri, 40% genomnya tersusun atas CRISPR sedangkan pada genom archaea tersusun 90%. Fungsi dari gen CRISPR adalah sebagai sistem imun pada prokarita tersebut dari infeksi, konjugasi, dan transformasi akibat serangan materi genetik asing.4

CRISPR associated proteins  yang disingkat menjadi Cas adalah enzim endonuklease yang dihasilkan oleh gen dari “cas operon”. Gen cas terdapat dua kelas, yakni kelas 1 yang merupakan sistem kompleks untuk memotong materi genetik asing, sedangkan kelas 2 hanya menggunakan protein tunggal dengan tujuan yang sama. Masing-masing kelas tersebut dibagi lagi menjadi tipe cas. Pada bahasan kali ini fokus pada kelas 2 yang menghasilkan tipe Cas9 dan tipe cas yang lainnya pada Gambar 5.

Komponen protein Cas9 tersusun atas empat yakni terdiri dari dua domain protein utama yakni REC dan RuvC (Gambar 6). REC dan RuvC dihubungkan oleh daerah yang kaya akan asam amino arginin (warna biru). Sementara dua komponen berikutnya yakni HNH dan PAM (Protosapecer-Adjacent Motif) yang merupakan urutan DNA yang tersusun 2-6 bp.4

Fungsi masing-masing komponen Cas9 yakni REC dan HNH berfungsi sebagai endonuklease (memotong DNA); RuvC berfungsi sebagai daerah sisi pengenalan (recognition site); PAM berfungsi untuk menyisipi urutan DNA target dengan segera ketika Cas9 mengenali DNA asing yang dijadikan target. PAM juga sebagai pengunci dalam proses sistem CRISPR/Cas9.

Aplikasi / Penggunaan dari CRISPR

Pada akhir tahun 2014 terdapat sekitar 600 makalah penelitian yang telah diterbitkan mengenai CRISPR. Teknologi ini telah digunakan untuk menonaktifkan gen secara fungsional pada sel manusia, untuk mempelajari Candida albicans, untuk memodifikasi ragi menjadi biofuel dan untuk memodifikasi strain tanaman. CRISPR juga dapat digunakan untuk memodifikasi nyamuk agar tidak dapat menularkan penyakit,  contohnya malaria.

1.Rekayasa genom

Editing genom CRISPR/Cas9 dilakukan dengan sistem CRISPR tipe II. Sistem ini mencakup Cas9, crRNA, tracrRNA bersama dengan template perbaikan DNA yang digunakan baik dalam Non-Homolog End Joining (NHEJ) atau Homology Directed Repair (HDR).(Gambar 7)
2.Knockdown / aktivasi

Menggunakan dCas9 mampu menghilangkan DNA CRISPR-dengan pemotongan, sambil menjaga kemampuannya menargetkan sekuens yang diinginkan. Beberapa ahli menambahkan berbagai faktor regulasi terhadap dCas9, memungkinkan  mengubah hampir semua gen menjadi aktif atau nonaktif atau menyesuaikan tingkat aktivitasnya. Seperti RNAi,  CRISPR mematikan gen secara reversibel dengan targeting, tapi tidak memotong sebuah situs. Situs target termetilasi, secara epigenetik memodifikasi gen. Modifikasi ini menghambat transkripsi. Cas9 adalah cara yang efektif untuk menargetkan dan menghentikan gen-gen tertentu pada DNA.7

3.Pengeditan RNA

Banyak virus mengkodekan informasi genetik nya pada RNA daripada DNA dengan tujuan meuntuk membuat virus baru. Contohnya virus HIV dan virus polio. Bakteri dengan C2c2 membentuk molekul yang dapat memotong-motong RNA, menghancurkan virus. Gen ini membuka setiap molekul RNA untuk dilakukan editing.8

4.Model Penyakit

CRISPR memudahkan menciptakan hewan penelitian yang dapat meniru penyakit atau menunjukkan mutasi gen atau knocked down. CRISPR dapat digunakan pada tingkat germline membuat perubahan gen hewan, atau mungkin pada sel target non-germline.

5.Mengendalikan Gen

Pada tahun 2015 tim di AS menggunakan CRISPR untuk membuat “reaksi berantai mutagenik” yang meningkatkan pigmentasi hewan Drosophila generasi berikutnya dengan efisiensi 97%. Kelompok peneliti lain mengendalikan gen nyamuk untuk menyebarkan gen yang dapat mencegah serangga menyimpan parasit malaria.

6.Biomedicine

CRISPR/Cas tergantung ” RNA-guided nucleases ” dapat digunakan untuk menentukan faktor virulensi, gen yang mengkode resistensi antibiotik dan lainnya. Teknologi ini dapat menunjukkan terapi novel antimikroba dan strategi memanipulasi populasi bakteri.9

 Clustered regularly interspaced short palindromic repeat (CRISPR)-associated protein 9 (CAS9), sebagai regulator baru modifikasi germline target selama spermatogenesis

4.1.Editing pada Embrio

Teknologi CRISPR/Cas9 memungkinkan mempermudah mengedit genom embrio dimana melibatkan tiga langkah utama (Gambar 8): (1) isolasi zigot dari super-ovulasi hewan betina, (2) pengiriman sgRNA dan Cas9 mRNA ke dalam zigot, dan (3) selanjutnya transfer embrio ke dalam hewan hamil-palsu (pseudo pregnant) untuk menghasilkan generasi F0 viabel. Konsentrasi sgRNA dan Cas9 merupakan faktor penting untuk dipertimbangkan. Konsentrasi  sgRNA dan Cas9 yang tinggi toksik bagi embrio, sedangkan konsentrasi rendah menghasilkan efisiensi target menjadi rendah. Normalnya konsentrasi mRNA dan sgRNA Cas9 adalah 10-100 ng/μL dan 5-50 ng/μL.10

Pada tahun 2013, tikus knock-out gen pertama menggunakan CRISPR / Cas9 ditemukan di laboratorium Jaenisch. Peneliti menyuntikkan Tet1 dan Tet2 sgRNA dengan mRNA Cas9 ke dalam zigot, yang mengakibatkan terbentuknya tikus bermutasi hingga 80% pada kedua gen. Tak lama setelah itu, peneliti lain melaporkan hasil studi yang sama. Studi ini menunjukkan bahwa sistem CRISPR/Cas9 adalah pendekatan yang cepat, nyaman, dan efisien untuk produksi satu langkah dari tikus knockout, menyediakan platform baru untuk generasi hewan transgenik. Untuk saat ini, sistem ini telah berhasil digunakan untuk menghasilkan alel mutan dalam berbagai organisme, seperti tikus, babi, kambing, kelinci, anjing, monyet, dan embrio manusia. Biasanya, Cas9/sgRNA-gen knock-out hasilnya tak terduga, dalam beberapa kasus mengakibatkan mutasi non-fungsional. Editing genom yan spesifik dan tepat, seperti knock-out, knock-in, dan perbaikan gen, dapat dicapai dengan co-injeksi mRNA dan sgRNA Cas9 ke zigot terhadap template oligonukleotida untai tunggal.10

Variasi struktural seperti insersi, delesi, duplikasi, inversi, dan translokasi segmen DNA, berhubungan dengan penyakit genetik, yaitu seperti autisme, epilepsi, dan pankreatitis. Namun, masalah utama editing genom yang melibatkan insersi, delesi, atau inversi fragmen DNA besar adalah efisiensi yang rendah, karena makin besar fragmen DNA, semakin rendah efisiensi rekombinasi.

Mosaik dan chimera secara substansi berkurang ketika sel-sel donor klonal diperkaya dengan memodifikasinya dengan CRISPR/Cas9 dimanfaatkan oleh hewan babi dan kambing dengan transfer sel nukleat somatik ke oosit yang belum dibuahi (yaitu, kloning). Atau, editing germline langsung dalam donor sel induk spermatogonium akan menghindari embriogenesis totipoten dan pluripotent, sehingga menghilangkan pembentukan mutan keturunan mosaik/chimera. Di sini, kami melaporkan cara produksi tikus mutan yang efisien dengan mengedit gen spermatogonium melalui CRISPR/Cas9.

Editing gen pada  spermatogonial stem cells (SSCs)

Manipulasi genetik dari sel induk spermatogonium (SSC) oleh CRISPR/Cas9 adalah pendekatan lain untuk modifikasi garis germinal hewan secara efisien. Wu et al. berhasil menggunakan pendekatan ini dalam mengoreksi penyakit katarak pada tikus yang disebabkan oleh mutasi gen Crygc. Ia menerapkan sistem CRISPR/Cas9 untuk memperbaiki gen Crygc endogen dengan SSC secara in vitro. SSC yang membawa gen koreksi berdifferensiasi menjadi spermatid bulat setelah transplantasi ke testis tikus. Spermatid kemudian disuntikkan ke oosit matang, dan keturunan yang dihasilkan  bebas katarak. Manipulasi genom pada SSC dengan CRISPR/Cas9 juga telah dibuktikan pada tikus. 10

 

Leave a Comment

Filed under Uncategorized

Leave a Reply

Your email address will not be published. Required fields are marked *